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【新手必读】从RNA提取到qPCR:qPCR背景介绍(下)

发布时间:2020-07-28 16:05:55点击量:233

上一期介绍了荧光定量PCR与普通PCR的重要差别、qPCR的两个重要参数及数学原理,接下来继续为大家梳理定量方式和定量方法等相关内容。

qPCR常用的定量方式有:SYBR染料法、TaqMan探针法、分子信标。

SYBR染料法利用SYBR Green I分子的特点,SYBR Green I 是一种结合于所有双链DNAdsDNA)双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料(见图一)。

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图一

SYBR Green I 只有和双链DNA结合后才发荧光,游离的染料分子不发光,在新合成链延伸过程中SYBR Green I 掺入双链中,变性时DNA双链解开,SYBR Green I 游离出来,无荧光,过程参见图二。SYBR染料法需要注意引物的特异性,因为非特异扩增产物和引物二具体均为dsDNA,所以SYBR染料法只能通过引物来保证特异性,SYBR染料法的优点在于简单且成本较低;

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图二

TaqMan探针法核心是探针分子,TaqMan探针是单链DNA5’端偶联发光基团,3’端偶联淬灭基团,游离的完整探针是检测不到荧光信号的,发光基团发出的荧光会被淬灭基团吸收淬灭,探针被水解,发光基团和淬灭基团远离就可以检测到荧光信号(见图三)。

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图三

反应开始时,模板链经热变性解链形成单链,TaqMan探针优先跟模板链退火,引物随后退火到模板上,之后进行链的延伸,延伸过程中Taq酶发挥5-3’外切酶活性,遇到探针会从5’端逐个碱基切除探针,发光基团会跟淬灭基团分开,因此荧光检测系统可以接收到荧光信号,每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子形成,荧光信号的累积和PCR产物形成是同步的,整个过程参见图四。TaqMan探针法的特异性除了由引物提供,更由探针分子保证,因其退火温度更高,所以TaqMan探针法特异性更好,在一个反应体系中加入多条探针,可以做多个基因同时检测。

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图四

分子信标类似于TaqMan探针,5’端偶联有发光基团,3’端偶联淬灭基团,游离的探针因互补结构存在形成发卡结构,发光基团和淬灭基团距离非常近,发光基团发出的荧光会发生荧光共振能量转移现象(FRET),激发淬灭基团后信号衰减(见图五)。

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图五

qPCR反应开始的时候,因体系温度升高,发夹结构被破坏打开,分子信标茎环区跟模板链退火,发光基团跟淬灭基团分开,因距离较远,因此不会发生FRET,所有可以检测到荧光信号的变化,新合成链会将分子信标替换,脱离模板链的信标分子又重新形成发卡结构不再产生荧光信号,整个过程参见图六。分子信标因背景荧光极低及其高的特异性可以做SNP检测。

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图六

关于定量方式的选择,一般情况下,在科研中,绝大多数定量会选择便宜且方便的SYBR染料法,对于更严格的定量,可以选择TaqMan探针法;在医疗检验中,优先选择准确并且特异的TaqMan探针法。

除此之外以下方面可以作为参考:

SYBR染料法适用:特异性要求不是特别高的反应、分子数(拷贝数)超过1000的反应、探针实验前进行预实验、PCR条件非常成熟、无二聚体、无非特异扩增;

TaqMan探针法适用:特异性要求较高的实验、多重PCR(标记不同的荧光基团)、SNP检测、灵敏度要求较高的实验

一步法 VS 两步法

一步法和两步法qPCR的区别在于:两步法是先完成反转录,反转录引物为通用引物,后以cDNA为模板进行后续qPCR检测;一步法是直接以RNA为模板,在一个反应体系中先完成反转录,反转录引物为基因特异性引物(GSP),然后直接进行扩增,得不到cDNA,见图七。适用范围的差别在于,一步法适合单个基因多个模板检测;两步法适用于多个基因少量模板检测。

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图七

qPCR定量方法

定量方法包括相对定量和绝对定量,两者的重要差异在于相对定量的结果是差异性的结果,涉及比较;而绝对定量的结果是一个具体数值,对于基因表达量而言是基因的拷贝数,不涉及任何比较。

 相对定量首先需要确定一个内参基因,内参基因作用有检测样本材料中RNA是否降解、纠正样本加样的差异、校正cDNA合成速率差异及校正PCR抑制剂的影响,其本质作用是利用内参基因的Ct值对目的基因的Ct值进行均一化处理,常用的内参基因包括GAPDH、β-actin18S rRNA,使用的时候需要注意其序列必须是物种本身的特异序列,虽然其比较保守,但不同物种也会存在碱基差别。另外,相对定量需要确定参照物,因为涉及比较,参照物选择不同,所得的定量结果可能完全相反,经常选择的参照物一般是对照组或未处理组

相对定量实验方法包括两种重要方法:

1. ∆∆CT Method:使用内参基因定量所研究样品和参照样品的目的基因。内参基因与目的基因可以同时反应,也可以单独反应;

2. 双标准曲线法:对每个样品的内参基因和目的基因都做绝对定量,求出每个样品中内参基因和目的基因的绝对数量,然后根据相对定量的基本公式来求出目的基因的差异表达。绝对定量需要由标准曲线建立Ct值跟拷贝数之间的关系,标准曲线由标准品生成,标准品可以是已知浓度的RNA、质粒或合成的寡核苷酸链生成,定量未知模板时标准样品和未知样品必须同时反应;

绝对定量首先需要建立Ct值和拷贝数之间的线性关系,即标准曲线,标曲需要由标准品生成,标准品中基因序列要与待测样品中基因序列一致,从而保证引物在两者中扩增效率完全相同,标准品来源可以是质粒,纯化的PCR产物或者基因组DNA等。标准品在加样时需要注意体积最好大于2微升,以减少标曲误差,标曲是由不同梯度标准品生成,每个标准品梯度建立Ct值与拷贝数对数值之间的联系,落在标曲上的梯度点最好有5个及以上,至少3个点。标准品和待测样品同时反应,将待测样品检测的Ct值代入标曲后即可换算出待测样品中基因的拷贝数。