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【新手必读】从RNA提取到qPCR:实时荧光定量PCR背景介绍

发布时间:2020-07-28 15:44:08点击量:236

实时荧光定量PCRrealtime fluorescence quantitative PCR)是一种研究基因表达量的重要方法(以下简称为qPCR)。

qPCR的重要特点

qPCR基于PCR扩增反应,需要区分qPCR与普通PCR的重要差别。做普通PCR时会将得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳,通过核酸染料的染色借助于紫外凝胶成像仪进行观察,最后通过终产物进行定性或者半定量分析(如图一);

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图一


qPCR在反应体系中引入了荧光基团(染料或者探针),可借助于对PCR产物进行标记跟踪,实时在线监控反应过程,结合相应的软件可以对产物进行分析,计算待测样品模板的初始浓度(见图二)。

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图二

此可见,两种方法的重要差别在于研究的对象不同,普通PCR关注终产物,qPCR关注起始模板。

荧光定量PCR仪器工作原理

qPCR仪器的品牌和型号很多,从原理上分析,包含以下三个反应模块:激发光发射源,接收装置,PCR反应模块(见图三)。

由于体系中引入了荧光基团,需要激发光发射源发出一定波长的光线,遇到荧光基团会反射另外一个波长的光线,此时被接收装置实时接收,正是由于qPCR仪器比普通PCR仪器增加了这两个模块,因此,qPCR的耗材比普通PCR的耗材要求更高,其顶盖的透光性必须良好。在做qPCR时要注意不要徒手或者戴乳胶手套接触顶盖,一定要佩戴PE手套操作,防止杂质留在顶盖上影响荧光信号的发射及接收。

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图三

荧光定量PCR重要参数

qPCR有两个重要的参数,第一个参数是扩增曲线。图四为扩增曲线表示形式,横坐标代表循环数,纵坐标代表荧光强度或者相对荧光强度。反应开始时,荧光信号不稳定,呈现波动状态,随后信号会趋于稳定并且呈现指数性增长,到达一定循环数之后,荧光信号强度不再增加,持续稳定。扩增曲线展现出来为一条S型曲线,包括:基线期,指数扩增期,平台期。反应完成后,qPCR仪会以基线期荧光信号标准偏差的10倍生成一条阈值线,阈值线与扩增曲线产生交点,交点对应的横坐标代表Ct值,Ct值的含义代表每一个反应体系中荧光信号强度达到阈值时经历的扩增循环数,其本质不难看出就是循环数,它是荧光定量中唯一用于后续计算的数值,是后续定量计算的基础。

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图四


图五同为扩增曲线,作者完成个96个独立的qPCR反应,可以看出,尽管平台期不相同,但是在指数扩增前生成的阈值线,得到的96Ct值几乎一致,表明96个反应体系中模板量几乎一致,体现了Ct值具有重现性这一重要特性,阐明以起始模板量为研究对象的qPCR定量是非常准确的,而以终产物为研究对象的普通PCR,因为经历了整个PCR过程的指数性放大,其定量的准确性受到了限制。扩增曲线可以帮助判断反应的完整性,完整的扩增应该包含之前介绍的三个时期。

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图五

第二个重要参数是溶解曲线。溶解曲线在反应完成之后进行检测,反映温度和荧光值之间的关系,只有染料法才可以进行溶解曲线检测,探针法因探针水解后不能还原,故不能做溶解曲线分析。下面两张图都是溶解曲线,图六为原始数据,可以看出,随着温度升高,DNA双链会逐渐解开,结合的染料会释放出来,因此荧光信号会逐渐下降,到达一定温度范围,荧光信号出现跌落,进一步升高反应温度,因体系中均为单链DNA,故荧光值不再发生明显变化。

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图六

对整个过程进行求导后,得到图七展示的我们比较熟悉的溶解曲线图,缓慢下降及最终的荧光信号稳定不再下降求导后为直线,急剧跌落求导后为峰值,因此一个峰对应一次荧光信号的跌落,每次跌落代表在这个温度范围内有一个双链产物被大量解链,因此单峰代表只有一个特异产物,多于一个峰代表存在非特异扩增产物或者引物二聚体,溶解曲线帮助我们判断的是反应的特异性。总结一下,通过扩增曲线和溶解曲线分析,只有完整而且特异的反应,Ct值才真实可信,才可以使用Ct值去进行后续的定量计算。

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图七

荧光定量PCR数学原理

要理解为什么可以用循环数本质的Ct值去进行定量计算,必须基于一定的数学原理。定义初始模板量为X0,第n次循环之后产物量为Xn,理想PCR反应,Xn=X0×2n,非理想PCR,我们定义引物扩增效率为ExXn=X0×(1+Exn,两边同时取对数,将Ct值和达到Ct时产物的量X(Ct)代入整理的公式,lg X0= (- lg(1+Ex) ) ×C(t)+ lg Xc(t)这个最终的方程表明初始模板浓度的对数与Ct值呈线性关系,正是线性关系的存在,所以我们可以用Ct值来进行后续表达量的计算,它是进行计算的基本数学原理。

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荧光定量PCR国际标准

最后,推荐一篇发表在临床化学上的文章,The MIQE Guidelines。它提出发表文章时所要求的最低限度的必要信息标准,同时文章对qPCR的术语、概念、研究与临床应用、样本的采集、处理和制备、核酸的质量控制、反转录、qPCR过程及数据分析等方面的操作标准和规范都做了详尽的阐述。