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【新手必读】从RNA提取到qPCR:反转录相关概念及实验策略

发布时间:2020-07-28 15:37:12点击量:246

1970Baltimore, D. Temin, H. M.等学者发现了反转录酶,证明遗传信息不仅由DNARNA,也可由RNADNA ,这一发现对分子生物学的中心法则进行了修正和补充。 

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反转录就是反转录酶以RNA为模板,根据碱基互补配对原则,合成cDNA的过程。

一.反转录酶的概述

1反转录酶的酶学特性

具有依赖于DNA RNA模板的DNA聚合酶活性, 反转录酶中不具有3′→5′外切酶活性,因此没有校正功能,所以由反转录酶催化合成的DNA出错率比较高。

具有降解DNA:RNA杂合双链中RNARNase H活性;

DNA聚合酶活性和RNase H活性均为病毒复制循环所必需。这两个活性中心在结构上是相互独立、单独折叠的两个结构域,在反转录酶上的相对位置固定。其中,DNA 聚合酶结构域位于N端,RNase H结构域位于C端;

2反转录酶的结构研究

Kohlstaedt L A等研究者于1992年在Science上发表一篇报道,提出了HIV-1 RTase的右手结构模型,其中“手指”是与合成中引入的脱氧核苷酸相互作用,“拇指”是与模板相互作用,“手掌”是催化磷酸转移。

3 DNA聚合酶活性

DNA聚合酶活性的持续合成能力是RT酶与引物/模板结合,延伸,解离这样一个循环所能掺入的核苷酸的平均数目;RTase的持续合成能力比较低 ,通常条件下小于1 kb;所以要继续链的延伸,必需有RTase分子重新结合到引物/模板复合物上

DNA聚合酶活性的保真性是比较低的,RT酶错配率是10-610-4,而宿主DNA聚合酶错配率是10-1110-7,这主要是由于RT酶缺乏5-3’和3-5’外切酶活性。

4 RNaseH活性

RNase H活性为病毒生命周期中复制循环所必需;可以降解DNA:RNA杂交链上的RNA RNase H活性限制了RT酶的合 成长度;我们可以通过RNase H Minus提升cDNA合成长度。

 

5几种代表性RT

常见代表性RT酶有HIV1 RTaseAMV RTaseMMLV RTase。其中,HIV1 RTase是研究最早、最透彻的RT酶;AMV RTase是源自禽成髓细胞瘤病毒 (禽源),该酶的RNase H活性强,合成长度短,合成量低,热稳定性好(4255℃);MMLV RTase是源自莫洛尼鼠白血病病毒 (鼠源),该酶的RNase H活性弱,合成长度长,合成量高,热稳定性差(3742℃)。

二.反转录实验策略

1常规反转录方法与优化的反转录方法

常规的反转录体系需要把模板、引物、dNTP、反应缓冲液、RNA 酶抑制剂和反转录酶等组分逐一加入同一PCR管,然后进行反转录。

优化的反转录体系(以我们公司AT321产品为例)就是在反应时,只需加入模板RNA和水即可高效合成第一链cDNA。操作简便,降低操作过程中的污染机率。

常规的反转录程序需要1.5h,而优化后的反转录程序只需要0.5hfor PCR),或者15minfor QPCR),这样大大节约的时间。

2反转录效率的影响因素

RNA模板的品质不好会对反转录效率造成一定的影响。

常用的反转录引物有Random primerOligo(dT) primerSequence-specific primer

Random primer可以随机与模板结合,然后进行反转录;Oligo(dT) primer与真核生物的mRNAPolyA)进行有效地结合,然后进行反转录;Sequence-specific primer是针对特定基因设置的引物,多用于一步法荧光定量PCR实验。

当反转录体系中加入引物是Oligo(dT) primer时,如果mRNA模板有些高级结构,那么cDNA合成过程中就会受阻,mRNA上远离3’端的基因和高级结构处的基因序列就无法获得。若在前面的反转录体系中再加入Random primer,那么就可以获得mRNA上远离3’端的基因,但是高级结构处的序列仍无法获得,这个在后面的内容会详细介绍。

反转录酶对反转录效率影响主要包括RNase H活性、聚合酶活性的合成能力、RT酶保真性和热稳定性RT酶等等。

RNase H活性在前面内容已有介绍,这里不再赘述;

聚合酶活性的合成能力主要取决于RT酶的动力学范围,它是指对不同浓度RNA模板的RT效率一致时,RNA模板的浓度范围。因此,我们要选择高品质RT酶,这种RT酶的动力学范围宽广,对低浓度RNA可以有效反转,并且对高浓度RNA没有抑制。

RT酶保真性低原因是缺乏3 -5’外切酶活性,那么我们可以在RT酶中加入具有3-5’外切酶活性的蛋白,赋予其校正功能,实现高保真RT-PCR

RT酶热稳定性提高,可以打开复杂模板中二级结构,cDNA合成继续,但是要求RT酶热稳定性高,这个问题可以通过点突变提高RT酶的热稳定性来解决。

3去除基因组的同时反转录

传统去除gDNA的方法是使用DNase Ⅰ处理,随后再对该酶进行失火,操作繁琐;我们公司目前研发出一款新的酶-gDNA Remover,可以有效地切割双链DNA,但对单连DNA没有作用;所以cDNA合成步骤和DNA去除步骤同时进行,RTase失活和 gDNA Remover失活同时进行。

4 microRNAmiRNA)的概述及检测

microRNA在动植物体内广泛存在,可以抑制特定基因表达,在表达调控中有重要作用;microRNA序列高度保守,长度18 25 nt 

microRNA检测方法有Northern BlotMicro arrayReal-time RT-PCRqRT-PCR)等。

其中,Real-time RT-PCRqRT-PCR)实验方法可进行高通量检测,也可检测微量miRNA;可区分前体miRNA与成熟miRNA;可区分单碱基差异;并且易于操作。

qRT-PCR检测microRNA时,可通过miRNA特异引物和miRNA加尾法合成较长的cDNA序列,方便后续基因的检测。