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【新手必读】带你认识核酸提取的原理

发布时间:2020-07-28 15:14:47点击量:395

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一.核酸抽提原理:

核酸抽提包含样品的裂解和纯化两大步骤。其是:裂解样品中的核酸游离在体系;纯化游离的核酸,使之与体系中的其它成分分离(如蛋白质、盐及其它杂质彻底分离)。

常用的裂解液:包括去污剂 (如 SDS、Triton X-100、NP-40、Tween 20 等) 和盐 (如 Tris、EDTA、NaCl 等)。

去污剂的作用,是通过使蛋白质变性、破坏膜结构、解开与核酸相连接的蛋白质,从而实现核酸游离在裂解体系中。

盐的作用,除了提供一个合适的裂解环境 (如 Tris),还包括抑制样品中的核酸酶在裂解过程中对核酸的破坏 (如 EDTA)、维持核酸结构的稳定 (如 NaCl) 等。

裂解体系中还可能加入蛋白酶,利用蛋白酶将蛋白质消化成小的片段,促进核酸与蛋白质的分开,同时,也便于后面的纯化操作以及获得更纯的核酸。也有直接使用高浓度的蛋白质变性剂 (如 GIT、GuHCl 等) 裂解的,该方法已经成为了 RNA 抽提的主流,却不是基因组 DNA 抽提的主流。

二.最常用的纯化方法

(一) PC 抽提(Phenol-chloroform extraction:酚氯仿抽提)+醇沉淀:利用PC对裂解体系进行反复抽提以去除蛋白质,实现核酸与蛋白质的分离,再用醇将核酸沉淀下来,实现核酸与盐的分离。

(二)介质纯化:利用某些固项介质,在某些特定的条件下,选择性地吸附核酸,而不吸附蛋白质及盐的特点,实现核酸与蛋白质及盐的分离。

(三)高盐沉淀去除蛋白质是第一种纯化方法的一个变体,省略了PC操作的麻烦,也有不纯化的抽提方法,但是用途多局限于简单的 PCR。

三.裂解方法的评价

(一)含蛋白酶的裂解方法是抽提基因组 DNA 的首选。包括裂解游离的膜蛋白与基因组 DNA 相连接的游离蛋白质。

(二)不使用蛋白酶的去污剂裂解方法,在细胞基因组 DNA 抽提方面仍然有优势。尤其是当得率和纯度要求不是最高,而经济性及操作简单很重要时,控制好裂解液/样品的比例是该方法成功的关键。该方法结合高盐沉淀,可以实现最简单的操作,但纯度及得率的稳定性可能会比用 PC 抽提的差一些。

(三)高浓度蛋白质变性剂 (如 GIT、GuHCl 等) 的裂解方法是抽提 RNA 的首选。

(四)含 CTAB 的裂解液,几乎成为富含多糖的样品,如细菌、植物的基因组 DNA 抽提的首选裂解方法。

(五)SDS 碱裂解法是质粒抽提的首选裂解方法,具有快速、得率高、几乎无基因组 DNA 污染的特点。

(六)PCR 模板的简易裂解方法,也是使用面很广的一类方法。该方法的特点是无须纯化,样品被裂解后即可直接取裂解液用于 PCR,非常快速。

四.纯化方法的评价

(一)PC 抽提/醇沉淀方法:稳定、可靠、经济、方便。PC 抽提可以彻底去除蛋白质,醇沉淀可以去除盐,对于一般的干净的样品 (杂质为蛋白质),该方法完全可以获得高质量的核酸。

(二)高盐沉淀蛋白质/醇沉淀方法:同样也是一个非常不错的方法。与 PC 抽提方法相比,除了纯度的稳定性可能要低一点外,该方法几乎克服了 PC 抽提的所有缺点。更快、更轻松去除蛋白质所伴随的好处是,可以用于大规模抽提,不足是纯度 (蛋白质残留) 不够稳定。

(三)介质纯化方法:是一个越来越受到重视的方法。其最大特点是非常适合大规模核酸抽提,并且因为受人为操作因素影响小,纯度的稳定性很高 (虽然纯度不一定比PC 纯化方法更高)。其致命弱点是样品过量。介质可以分为两大类,一类是柱式的,即介质被预先装填在下面是通的柱子里;另外一类则是颗粒状 (如Glassmilk、磁性小珠等)。

五.醇的沉淀

醇的沉淀,目的是使核酸从裂解体系中沉淀下来,从而实现核酸与其它杂质(主要是盐)的分离。实际操作中,许多杂质也会与核酸一起被醇沉淀下来,尤其是当其它杂质的浓度也比较高的时候。醇的沉淀并不是非常特异性的,任何有机大分子及一些盐,当浓度达到一定水平后,都可能同步被沉淀下来。最有参考价值的是 TRIzol 提供的一个沉淀方案:一半异丙醇加一半高盐溶液替代纯粹的异丙醇,可以大大降低多糖残留。

PEG、LiCl、CTAB 都可以用于核酸沉淀。虽然它们远没有醇沉淀的高使用频率,但却各有特点。LiCl 可以沉淀 RNA 以去除 DNA,CTAB 可以从含多糖的裂解体系中将核酸沉淀下来。PEG 是沉淀病毒颗粒的方便手段。

六.洗涤

洗涤首先一定要将沉淀悬浮起来;第二就是要有一定的时间,尤其是当核酸沉淀比较大时 (使核酸沉淀最终蓬松);第三是少量多次;第四则是去上清要彻底。

七.核酸质量的检测问题

目前用于正式实验前检测核酸质量的方法,一是电泳,二是紫外分光光度仪。

(一)电泳检测的主要是核酸的完整性和大小,只要核酸不是太小或者太大 (超出电泳分离范围),电泳还可以用于估计核酸的浓度,但其准确度与经验有关;另外,电泳也可能提供某些杂质污染的信息。

(二)紫外分光光度仪检测的是纯度和核酸含量,该仪器的灵敏度非常高,A230 : A260 : A280 = 1 : 2 (DNA 为 1.8) : 1 为理论上的数据,实际测定时会有一些差别;但如果差别太大,就有问题了。 如: A260/A230 > 2 就是纯的,如果 A260/A280 > 2.3 就是核酸降解,A260/A230比2大许多,一定是有杂质残留的。

八.核酸的溶解和保存

纯化后的核酸,最后多使用水或者低浓度缓冲液溶解;其中 RNA 以水为主,DNA 则多以弱碱性的 Tris 或者 TE 溶解。经典的 DNA 溶解方法多提倡使用 TE 溶解,认为 EDTA 可以减少 DNA 被可能残留下来的 DNase 降解的风险;如果操作过程控制得当,DNase 的残留几乎是可以忽略的,完全可以直接使用 Tris 或者水 (pH 接近 7) 溶解 DNA。

实验室常用保存方法: -20℃保存的 DNA, -70℃保存的RNA。